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細(xì)胞能量代謝服務(wù)Seahorse XF實(shí)驗(yàn)---常見(jiàn)問(wèn)題及解答
更新時(shí)間:2020-11-10   點(diǎn)擊次數(shù):6042次

代謝在細(xì)胞和生理過(guò)程中的作用已經(jīng)很明確,現(xiàn)在認(rèn)為許多疾病都與代謝功能障礙或重編程有關(guān)。安捷倫 Seahorse XF 技術(shù)簡(jiǎn)化了細(xì)胞能量代謝分析。該技術(shù)利用免標(biāo)記方法實(shí)時(shí)測(cè)量活細(xì)胞的兩條能量代謝通路,量化細(xì)胞代謝表型,從而分析細(xì)胞功能的變化。

     XF 技術(shù)通過(guò)測(cè)定氧氣消耗速率(Oxygen Consumption Rate, OCR)來(lái)反映細(xì)胞線粒體的功能,通過(guò)測(cè)定細(xì)胞外酸化速率(Extra Cellular Acidification Rate,ECAR)來(lái)反映糖酵解功能。

     將細(xì)胞接種到孔中,并可以將多四種藥物(例如抑制劑或激動(dòng)劑)自動(dòng)添加到細(xì)胞中。在探針板中,每個(gè)探針?biāo)闹芘帕辛怂膫€(gè)集成的加藥口。將藥物依次注入孔中,并通過(guò)探針與檢測(cè)液混合。實(shí)時(shí)測(cè)定藥物誘導(dǎo)的細(xì)胞代謝動(dòng)態(tài)變化。

   

提問(wèn)

Qustions&解答Answers

Seahorse XF 實(shí)驗(yàn)常見(jiàn)問(wèn)題及解答

01可以使用超出保質(zhì)期的探針板或重復(fù)使用探針板嗎?

     Agilent 無(wú)法保證因使用超出保質(zhì)期的探針板或重復(fù)使用探針板而得到的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)質(zhì)量(有效性),為得到較佳的、真實(shí)的數(shù)據(jù),請(qǐng)使用有效期內(nèi)的探針板及其它消耗品。

 

02探針板水化超出水化時(shí)間怎么辦?

     Agilent建議將探針板放入37℃無(wú)CO2培養(yǎng)箱中水化過(guò)夜以得到優(yōu)結(jié)果。短水化時(shí)間是37℃水化12小時(shí)。探針板長(zhǎng)水化時(shí)間是37℃水化72小時(shí),但由于液體蒸發(fā)需要補(bǔ)充(或更換)校準(zhǔn)液,因此37℃無(wú)CO2培養(yǎng)箱務(wù)必放置水盤保證濕度。

 

03Fluxpak各種探針板有什么區(qū)別?

     探針板是Fluxpak的組成部分,一個(gè)Fluxpak包含探針板、水化板、校準(zhǔn)液和細(xì)胞培養(yǎng)微孔板。以上各消耗品數(shù)量因所購(gòu)Fluxpak類型而不同。探針板不能單獨(dú)訂購(gòu),必須通過(guò)訂購(gòu)Fluxpak來(lái)購(gòu)買,但細(xì)胞培養(yǎng)板和校準(zhǔn)液可單獨(dú)購(gòu)買。訂購(gòu)前,需要了解使用機(jī)器的型號(hào)及所需要的實(shí)驗(yàn)次數(shù),訂購(gòu)與之配套的Fluxpak。

 

04計(jì)劃明天做實(shí)驗(yàn),我今天要做些啥?

     實(shí)驗(yàn)前一天,打開(kāi)主機(jī),打開(kāi)電腦,同時(shí)點(diǎn)開(kāi)Wave軟件,確保是Connected的狀態(tài),水化探針板,貼壁細(xì)胞提前接種到Seahorse的細(xì)胞培養(yǎng)板里。

 

05探針板水化聽(tīng)說(shuō)有二步,是這樣嗎?

     是的,96孔探針板,實(shí)驗(yàn)前一天,用無(wú)菌水;第二天做實(shí)驗(yàn)前,棄去無(wú)菌水,更換上37℃預(yù)熱好的校準(zhǔn)液,再放置無(wú)CO2恒溫箱孵育1小時(shí),這樣二步法水化,大程度避免了探針頭上的小氣泡;24機(jī)型探針板一步法水化即可,但是還是建議用之前手動(dòng)排一下氣泡;

 

06一次實(shí)驗(yàn)可以只使用探針板其中的一部分嗎?

     為了將所有藥物或化合物成功地注入細(xì)胞培養(yǎng)孔中,Agilent建議水化整個(gè)探針板并因需要將相同字母標(biāo)注的全部加藥孔注入藥物(請(qǐng)參考實(shí)驗(yàn)流程中關(guān)于加載藥物的注意事項(xiàng))。背景孔的加藥孔也必須加上藥物,保證所有的A加藥孔體積一致,B、C、D孔同理,否則會(huì)造成打藥失??;

 

07實(shí)驗(yàn)中為何必須設(shè)置背景校正孔?

     背景校正孔被用來(lái)過(guò)濾掉實(shí)驗(yàn)的干擾因素,比如溫度和 buffering capacity,這些干擾因素會(huì)影響氧含量和pH變化(非來(lái)源于代謝變化的影響)。背景校正孔還能被用來(lái)修正整板間溫度波動(dòng),來(lái)診斷潛在溫度問(wèn)題,以及作為實(shí)驗(yàn)獲得非期望數(shù)據(jù)時(shí)原因篩查的切入點(diǎn)。

 

08背景校正孔怎么設(shè)置?

      背景校正孔里除了沒(méi)有細(xì)胞,其它所有操作和細(xì)胞孔一致。96機(jī)型背景校正孔(A1,A12, H1, H12,即4個(gè)角)不接種細(xì)胞;24機(jī)型背景校正孔設(shè)置為(A1, B4, C3, D6);確保背景校正孔中只加入培養(yǎng)液(無(wú)細(xì)胞)

 

09為何細(xì)胞培養(yǎng)板需要在 37℃無(wú)CO2 培養(yǎng)箱中放置45-60min?

     細(xì)胞培養(yǎng)板在37℃無(wú)CO2培養(yǎng)箱中孵育45-60min的目的是為了脫氣,釋放CO2。

 

10 Seahorse 實(shí)驗(yàn)時(shí),我擔(dān)心細(xì)胞量少,我多種點(diǎn)細(xì)胞可以嗎?

     細(xì)胞的密度需要摸索,在實(shí)驗(yàn)上機(jī)前,長(zhǎng)滿板底面積80-90%為較佳,設(shè)置一個(gè)密度梯度,找到的密度;細(xì)胞過(guò)密會(huì)使檢測(cè)時(shí)形成的瞬間微室氧氣快速耗盡。

 

11 Seahorse 實(shí)驗(yàn),種細(xì)胞和平時(shí)種細(xì)胞有區(qū)別嗎?

      安捷倫細(xì)胞培養(yǎng)板種細(xì)胞時(shí)候,槍頭抵壁,與水平面呈45°角度加入,加完在超凈臺(tái)靜置1小時(shí),有助于促進(jìn)細(xì)胞均勻分布并減少邊緣效應(yīng)。96孔細(xì)胞板種80ul;24機(jī)型的板子分二步,先每孔接種100 μL細(xì)胞懸液,培養(yǎng)細(xì)胞1-6小時(shí),細(xì)胞貼壁后,再補(bǔ)充生長(zhǎng)培養(yǎng)基,每孔加入150μL生長(zhǎng)培養(yǎng)液,總體積為250 μL。加液時(shí)沿壁輕輕加入,避免吹起剛貼壁的細(xì)胞。 

 

12 使用組織黏附劑處理細(xì)胞培養(yǎng)板會(huì)影響XF實(shí)驗(yàn)測(cè)量嗎?

     不會(huì)。使用諸如poly-L-Lysine,fibronectin,Gelatin,poly-D-lysine,Cell-Tak™等組織黏附劑處理細(xì)胞培養(yǎng)板時(shí),不會(huì)影響XF儀器測(cè)量的效果及實(shí)驗(yàn)參數(shù)分析。

 

13 XFp/XFe96細(xì)胞培養(yǎng)微孔板的每個(gè)細(xì)胞孔的大體積及底面積是多少?

       275 µL;底面積是正常96孔板底面積的40%。

 

14 XFe24細(xì)胞培養(yǎng)微孔板的每個(gè)細(xì)胞孔的大體積及底面積是多少?

      1000 µL;底面積和正常96孔板底面積一樣大小。

 

15 Seahorse XF檢測(cè)液中需要加入抗生素嗎?

      無(wú)需加入抗生素,因?yàn)榇蟛糠諼F實(shí)驗(yàn)在幾小時(shí)內(nèi)就結(jié)束了。

 

16可以在Seahorse檢測(cè)液中加入血清嗎?

      不建議加入血清(如:FBS),因?yàn)槠鋾?huì)影響檢測(cè)液的緩沖能力,并可能與進(jìn)行檢測(cè)的藥物/化合物發(fā)生非特異性結(jié)合而影響檢測(cè)效果,同時(shí)容易產(chǎn)生氣泡。另外,使用加入血清的檢測(cè)液溶解藥物加載至探針板加藥孔中進(jìn)行注射時(shí),會(huì)出現(xiàn)漏藥或加藥注射失敗。

 

17加入底物的檢測(cè)液在多長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)可保持穩(wěn)定?或可以提前配好檢測(cè)液和藥物嗎?

      Seahorse檢測(cè)液在實(shí)驗(yàn)當(dāng)天現(xiàn)用現(xiàn)配。藥物也要現(xiàn)配現(xiàn)用,溶解后的藥物要一次性用完,剩余的也不能用于下次實(shí)驗(yàn)了。

 

18 Seahorse XF糖酵解壓力試劑盒中的藥物狀態(tài)看上去很奇怪,是否有質(zhì)量問(wèn)題(或其他試劑盒中部分藥物)?

      如Glycolysis stress test kit中的2-DG,該藥可能是透明的液體、不透明的(白色的)固體,也可能是白色固體與透明液體的混合物,以上藥物狀態(tài)均不影響其性能,可按照說(shuō)明書正常溶解使用。

 

19使用pH 7.4 的 XF DMEM 或 RPMI 基礎(chǔ)培養(yǎng)基制備檢測(cè)液時(shí),加上Seahorse的三個(gè)底物,是否就無(wú)需調(diào)整pH了?

      是的。使用推薦的 XF 三個(gè)底物,能確保分析培養(yǎng)基終 pH 值的準(zhǔn)確。如果使用其他供應(yīng)商提供的其他品牌的補(bǔ)充劑,則無(wú)法保證培養(yǎng)基pH 值的準(zhǔn)確。啟封后的pH7.4的DMEM或RPMI基礎(chǔ)培養(yǎng)基,盡可能在一個(gè)月內(nèi)用完,以免pH值因?yàn)榭諝庵械腃O2進(jìn)去,影響pH值。

 

20Seahorse的基礎(chǔ)培養(yǎng)基與其他廠家的有啥不同?

       Seahorse XF 培養(yǎng)基于 XF 分析,推薦研究者使用,以獲得佳試驗(yàn)結(jié)果。XF 培養(yǎng)基以標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞培養(yǎng)基組分(DMEM 或 PRMI)為基礎(chǔ),做了以下這些方面改進(jìn):

 無(wú)碳酸氫鹽和低緩沖容量:利于細(xì)胞外酸化率的檢測(cè) 

 無(wú)底物添加:適用于用戶的各種不同需求 

 低濃度酚紅或無(wú)酚紅:確保 pH 值測(cè)量的準(zhǔn)確性 

 

21請(qǐng)問(wèn)進(jìn)行FAO實(shí)驗(yàn)時(shí),能夠在探針板上加載BSA-palmitate使其在上機(jī)測(cè)量時(shí)自動(dòng)注射入細(xì)胞孔嗎?

      Agilent建議將BSA-palmitate或相似底物在培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)做預(yù)處理。如果實(shí)驗(yàn)存在合理依據(jù)需在上機(jī)測(cè)量時(shí)通過(guò)注射加BSA-palmitate、血清或其他類似底物,請(qǐng)聯(lián)系相關(guān)技術(shù)支持。

 

22 為何不能使用XF base medium配制的檢測(cè)液進(jìn)行Glycolytic rate與real-time ATP rate兩個(gè)實(shí)驗(yàn)?

      XF base medium中含有酚紅,該物質(zhì)會(huì)影響這兩個(gè)實(shí)驗(yàn)的測(cè)量。

 

23 為何不能使用GlutaMAX來(lái)代替Glutamine呢?

     不建議使用GlutaMAX來(lái)配制檢測(cè)液。因加入GlutaMAX后,還需細(xì)胞進(jìn)一步將其轉(zhuǎn)化為glutamine,這可能會(huì)影響線粒體對(duì)Glutamine氧化的動(dòng)力學(xué)過(guò)程。

 

24 檢測(cè)液的pH對(duì)XF實(shí)驗(yàn)非常重要嗎?

    是的,Seahorse XF實(shí)驗(yàn)通過(guò)測(cè)定細(xì)胞代謝物(如:氧和質(zhì)子)的變化來(lái)確定OCR 和ECAR,而檢測(cè)液pH會(huì)影響這些代謝物的產(chǎn)生或消耗,因此保持檢測(cè)液一致的 pH(37℃,pH=7.4± 0.1)非常重要。

 

25 FluxPak中的水化板可以替代細(xì)胞培養(yǎng)板嗎?

      不可以,雖然水化板與細(xì)胞培養(yǎng)板結(jié)構(gòu)相同,但不能用來(lái)培養(yǎng)細(xì)胞。

 

26 Seahorse 探針板上機(jī)前加藥,需要注意什么?

       加藥時(shí)同樣方法,槍頭抵著加藥孔壁大約與水平面呈45°度角,將液體一次性加入到加藥孔中,注意板子始終保持在平面上,加完藥的探針板不能晃動(dòng),以免加入的液體漏入水化板中。(24的機(jī)型,在加藥前需要取下粉色的水化輔助板);

 

27 Seahorse 細(xì)胞板上機(jī)時(shí)候,放進(jìn)去應(yīng)該就可以了?

       探針板和細(xì)胞板放入儀器時(shí),朝向?yàn)锳1孔朝向機(jī)器內(nèi)部,記得把蓋子拿掉;

 

28 Seahorse XF報(bào)告生成器中的代謝數(shù)據(jù)是如何計(jì)算的?

      在每個(gè)試劑盒的Seahorse XF報(bào)告生成器的用戶指南中詳細(xì)列出了數(shù)據(jù)的計(jì)算公式,請(qǐng)參閱。

 

29 Seahorse數(shù)據(jù)分析軟件Wave可以免費(fèi)下載安裝嗎?

      是的,可在安捷倫找到Wave軟件下載,并且免費(fèi)下載安裝。

 

30 Seahorse XF 儀器模板選項(xiàng)中沒(méi)有想檢測(cè)試劑盒的模板怎么辦?

     可在桌面板wave軟件中將相應(yīng)實(shí)驗(yàn)?zāi)0逑葘?dǎo)出到 U 盤中,再導(dǎo)入XF 儀器模板庫(kù)即可。

 

31 Seahorse數(shù)據(jù)分析軟件導(dǎo)出選項(xiàng)中沒(méi)有對(duì)應(yīng)的report generator?

      當(dāng)軟件導(dǎo)出選項(xiàng)中無(wú)相應(yīng)的report generator時(shí),請(qǐng)移步到Agilent細(xì)胞分析軟件下,下載wave分析軟件,也可以在對(duì)應(yīng)試劑盒的菜單中下載對(duì)應(yīng)的report generator。

 

32 Seahorse Wave 分析軟件,我的電腦怎么都安裝不上,怎么辦?

     當(dāng)軟件無(wú)法安裝時(shí),可采用 Seahorse Analytics云分析, 這是一款網(wǎng)頁(yè)形式的 Seahorse XF 數(shù)據(jù)分析軟件,用戶可以通過(guò)任何一臺(tái)電腦安全地存儲(chǔ)、訪問(wèn)和分析數(shù)據(jù)。較地簡(jiǎn)化了用戶的數(shù)據(jù)分析流程

 

33 Seahorse XF 實(shí)驗(yàn)后,是否需要做歸一化處理呢,有哪些方法呢?

     功能生物數(shù)據(jù)的歸一化是原始數(shù)據(jù)展示和后續(xù)分析工作流程中的關(guān)鍵因素,以確保對(duì)結(jié)果的準(zhǔn)確一致的解析。XF 代謝分析在這方面也是如此,大多數(shù)實(shí)驗(yàn)需要進(jìn)行某種形式的歸一化。無(wú)論是比較不同的細(xì)胞類型、基因修飾還是化合物處理,都必須根據(jù)共同的參數(shù)將數(shù)據(jù)歸一化以便正確比較。

     常用的方法,蛋白定量,細(xì)胞成像計(jì)數(shù),核DNA的檢測(cè)等。

 

34 購(gòu)買的Fluxpak包裝,為啥細(xì)胞板總是多幾塊呢?

    Agilent 充分考慮到實(shí)驗(yàn)中的各種情況,如果你發(fā)現(xiàn)細(xì)胞種的過(guò)密了或者發(fā)生了污染,那么就需要更換新的細(xì)胞板重新鋪板。

 

35 Seahorse相關(guān)試劑存儲(chǔ)條件是怎么的呢?

      Agilent 基礎(chǔ)培養(yǎng)基類,請(qǐng)4℃避光保存,避免凍結(jié)。FAO和谷氨酰胺需要存放在-20℃;板子及常見(jiàn)的試劑盒,室溫存儲(chǔ)即可。

 

36 Seahorse XF 相關(guān)試劑盒的說(shuō)明書在哪呢,有中文的嗎?

   Agilent 一直提倡遵循環(huán)保理念,當(dāng)您收到試劑盒后,標(biāo)簽面都有一個(gè)二維碼,掃描即可下載說(shuō)明書。部分有中文說(shuō)明書,請(qǐng)聯(lián)系相關(guān)技術(shù)支持索取。

   

37 Seahorse XFe24 組織胰島板能簡(jiǎn)單介紹下嗎?

     目前只要24機(jī)型配有組織胰島微孔板,其微孔板的腔室容積為16.6 µL;

其網(wǎng)狀捕獲篩孔徑為125 µm。

 

38 Seahorse 啥數(shù)據(jù)能大致判斷實(shí)驗(yàn)結(jié)果靠譜不?

      通過(guò)大量的結(jié)果數(shù)據(jù),24機(jī)型基礎(chǔ)OCR值范圍50~400(pmol/min),基礎(chǔ)ECAR值范圍20~120(mpH/min);96機(jī)型基礎(chǔ)OCR值 范圍20~160(pmol/min),基礎(chǔ)ECAR值范圍10~90(mpH/min)。這個(gè)范圍內(nèi)的值,還是比較靠譜的。

 

3 Seahorse  24/96 孔微孔板的尺寸是多少?

板類型

板寬度

板高度

板長(zhǎng)度

體積 (UL)

比表面積

96

85.5 mm

17.4 mm

127.8 mm

150-275

0.11cm2

24

85.5 mm

20.3 mm

127.8 mm

500-1000

0.28cm2

 

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